Презентация - Основные лабораторные показатели оценки эритропоэза, получаемые на гематологических анализаторах

Основные лабораторные показатели оценки эритропоэза, получаемые на гематологических анализаторах

RB С (red blood cells) - количество эритроцитов крови. Норма: : 3,9-4,5 Т/л : 4,3-5,3 Т/л RB С Общее число клеток – (PLT WBC) Считаются все частицы размером более 36 фл. Лейкоциты считаются в лизате после разрушения эритроцитов . Коэффициент вариации данного параметра составляет 1–2%, в некоторых приборах — менее 1%, а при ручном подсчете в камере – до 5% Поскольку размеры лейкоцитов близки к размерам эритроцитов, они неизбежно будут влиять на подсчет числа эритроцитов. Однако за исключением явных лейкоцитозов, это влияние будет незначительным, так как в норме количество эритроцитов в крови в тысячи раз превышает число лейкоцитов. В случаях гиперлейкоцитоза ошибка измерения эритроцитов возрастает.

Возможные ошибки измерения эритроцитов Ложное повышение Ложное понижение Гигантские тромбоциты (с объемом более 30 фл) Агглютинация эритроцитов ( MCV, MCH и MCHC) Криоглобулинемия ( RBC, WBC, Hb) Прогреть образец крови до 37ºС 30 мин и немедленно измерить Выраженный микроцитоз эритроцитов Высокий лейкоцитоз (более 50 Г/л) Гемолизированные образцы крови Криоглобулинемия может наблюдаться у больных миеломной болезнью, макроглобулинемией Вальденстрема, злокачественными новообразованиями, лейкозом, лимфопролиферативными и аутоиммунными заболеваниями и др.

Нормобласты (NRBC) - большинство гематологических анализаторов подсчитывает все ядросодержащие клетки, поэтому при наличии нормобластов в периферической крови они определяются как лейкоциты и могут быть причиной увеличения WBC и лимфоцитов, т.к. нормобласты имеют размер малого лимфоцита. В этих случаях необходим строгий визуальный контроль и коррекция истинного количества лейкоцитов. Например, WBC 45 Г/л. В лейкоцитарной формуле на 100 лейкоцитов - 50 нормобластов. Рассчитываем истинное количество лейкоцитов в крови: 150 кл – 45 г/л 100 кл – Х г/л (истинный лейкоцитоз крови)

HGB (hemoglobin) Концентрация гемоглобина (г/л) в большинстве гематологических анализаторов определяется фотометрически гемиглобинцианидным или гемихромными методами Коэффициент вариации при этом не превышает 2% Норма: HGB : 121-138 г/л HGB : 140-165 г/л Ложное повышение Ложное понижение Присутствие нестабильных гемоглобинов (Hb S, Hb C). Образование микросгустков в пробе крови Криоглобулинемия( RBC, WBC, Hb) Высокий лейкоцитоз (более 50 Г/л) Гиперлипидемия Парапротеинемия Гемолиз in vivo Резистентные к лизусу эритроциты Возможные ошибки измерения гемоглобина

Контролем за правильностью измерения концентрации гемоглобина может служить величина МСНС (средняя концентрация гемоглобина в эритроците), которая рассчитывается прибором путем деления концентрации гемоглобина в г/дг на гематокрит и умноженная на 100. Данный параметр может быть использован как индикатор ошибок, допущенных на аналитическом и преаналитическом этапах работы. HGB (г/дл) МСНС --------------------------- 100 ( г/дл ) Hematocrit (%) Основные причины завышения результатов определения концентрации гемоглобина обусловлены МУТНОСТЬЮ ОБРАЗЦА КРОВИ. Для снижения ошибки измерения гемоглобина рекомендуется обработать кровь лизатом, отцентрифугировать образец и провести измерение гемоглобина в надосадочной жидкости фотометрическим методом.

Различное влияние липидемии на определение гемоглобина в приборах связано с техническими особенностями, а не с методологией. Величина результирующей ошибки сильно зависит от оптической системы прибора: размера выходного отверстия из кюветы для образцов и расстояния до фотодиода. Сравнение значений параметров общего анализа крови больного хроническим лимфолейкозом и гиперлипидемией приведены в таблице. Наблюдаются выраженные различия по концентрации гемоглобина, сопровождающиеся повышением значения MCHC , что связано с разной оптической системой анализаторов. Марка анализатора WBC RBC PLT Hb MCV MCHC KX-21 (Sysmex ) 299.1 2.35 290 82 92.0 378 «Гемолюкс 19» 268.3 2.33 296 127 89.4 619

HCT (hematocrit) Показатель отражает долю объема крови, занимаемую эритроцитами; выражается в % вычисляется как сумма прямо измеренных объемов эритроцитов в единице объема крови по формуле: RBC MCV. Коэффициент вариации для автоматического метода — менее 1% Норма: HCT : 40-48 H CT : 36-42 Ложное повышение Ложное понижение Гигантские тромбоциты (с объемом более 30 фл) Агглютинация эритроцитов ( MCV, MCH и MCHC ) Криоглобулинемия ( RBC, WBC, Hb ) Высокий лейкоцитоз (более 50 Г/л) Диабетический кетоацидоз (гиперосмолярность, набухание эритроцитов) Выраженный микроцитоз эритроцитов (менее 36 фл) Гипергликемия (более 33 ммоль/л)

MCV (mean corpuscular volume) MCV – средний объем эритроцита - является измеряемым показателем, он определяется большинством гематологических анализаторов благодаря прямой зависимости амплитуды электрического импульса от объема клетки. Вычисляется MCV делением суммы клеточных объемов на число эритроцитов. В то же время MCV — это средний показатель объема всей популяции эритроцитов, содержащихся в диапазоне от 36–360 фл. Поэтому необходимо иметь в виду, что MCV может иметь нормальное значение при наличии у пациента одновременно выраженного макро- и микроцитоза , большом количестве аномальных эритроцитов (например, при серповидно-клеточной анемии, выраженном пойкилоцитозе). В этом случае особую диагностическую важность приобретает анализ эритроцитарной гистограммы и морфология клеток в мазках крови.

MCV (mean corpuscular volume) При наличии агглютинации эритроцитов прибор воспринимает агрегаты как одну большую клетку, если размер их меньше верхнего порога эритроцитарного канала, что приводит к увеличению MCV. Сохранение крови in vitro и измерение таких проб при 37 град. способствует получению правильных результатов. MCV является важным показателем в дифференциальной диагностике анемий. На основании MCV анемии разделяют на: нормоцитарные ( MCV 80-100 фл) микроцитарные (MCV менее 80 фл) макроцитарные (MCV более 100 фл) MCV ------------------------- H ematocrit RBC Норма: MCV : 80-100 фл

Ложное повышение Ложное понижение Гигантские тромбоциты (с объемом более 30 фл) Повышенное содержание в крови фрагментов эритроцитов вследствие механического гемолиза Криоглобулинемия ( RBC, WBC, Hb ) Высокий лейкоцитоз (более 50 Г/л) Диабетический кетоацидоз (гиперосмолярность, набухание эритроцитов) Коагулопатия потребления Длительное хранение крови (более 8 ч) Ретикулоцитоз Гипернатриемия Возможные ошибки измерения среднего объема эритроцитов - MCV - при наличии холодовой агглютинации эритроцитов в образце крови прибор воспринимает их как одну большую клетку, если размер их меньше верхнего порога эритроцитарного канала, что приводит к увеличению MCV. Сохранение крови in vitro и измерение таких проб при 37 С способствует получению правильных результатов.

MCH (mean corpuscular hemoglobin) среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците в абсолютных единицах МСН — более объективный параметр, чем устаревший цветовой показатель, который не отражает содержание гемоглобина в эритроците Параметр MCH является расчетным, поэтому к ложнозавышенным результатам приводят все факторы, влияющие на увеличение значений гемоглобина и снижение количества эритроцитов. Ложнозаниженные результаты MCH получаются вследствие ошибок, связанных с неправильным определением числа эритроцитов (завышения их количества) и занижения концентрации гемоглобина

MCH (mean corpuscular hemoglobin) Изменения МСН лежат в основе разделения анемий на нормохромные (МСН - 27-33 пг) гипохромные (МСН менее 27 пг) гиперхромные (МСН более 33 пг) Норма: MCH : 27-3 3 пг

MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration) МСНС показывает концентрацию гемоглобина в одном эритроците, т.е. соотношение содержания гемоглобина к объему клетки. Он отражает насыщение эритроцита гемоглобином МСНС является чувствительным показателем нарушения процессов гемоглобинообразования. МСНС рассчитывается прибором путем деления концентрации гемоглобина (в г/дг) на гематокрит и умноженная на 100. Увеличение МСНС свидетельствует об ошибках, допущенных при измерении пробы (погрешности определения Hb или MCV). Поэтому данный параметр часто используется в качестве индикатора ошибок, допущенных на аналитическом или преаналитическом этапах работы. Снижение значения МСНС наблюдается при заболеваниях, сопровождающихся нарушением синтеза гемоглобина.

HGB (г/дл) МСНС --------------------------- 100 ( г/дл ) Hematocrit (%) Норма: MCH С : 300-380 г/л MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration)

Различия между МСН и МСНС МСН указывает на массу гемоглобина в одном эритроците и выражается в долях грамма (пикограммах). МСНС показывает концентрацию гемоглобина в одном эритроците, т.е. соотношение содержания гемоглобина к объему клетки. Он отражает насыщение эритроцита гемоглобином. В отличие от МСН МСНС является чувствительным показателем нарушения процессов гемоглобинообразования.

Новые параметры Анализаторы серии "Technicon" непосредственно измеряют концентрацию гемоглобина в каждом отдельном эритроците и строят гистограммы распределения клеток по концентрации гемоглобина. При этом вводится новый показатель - ширина распределения эритроцитов по концентрации гемоглобина - HDW - hemoglobin distribution width, который характеризует гетерогенность эритроцитарного пула. LHD (low hemoglobin density), % - гемоглобин низкой плотности - новый параметр, который коррелирует с процентом гипохромных эритроцитов. Показатель LHD является индикатором железодефицитного состояния. Hypo% - процент гипохромных эритроцитов, имеет значение в диагностике гипохромных анемий и мониторинге терапии эритропоэтином. Более 10% гипохромных эритроцитов является индикатором железодефицитного состояния.

RDW (red cell distribution width) RDW — показатель гетерогенности эритроцитов по объему, характеризует степень анизоцитоза. Вычисляется большинством современных гематологических анализаторов на основании гистограммы распределения эритроцитов как коэффициент вариации объема эритроцитов: На этот показатель влияет MCV, поэтому как при микроцитозе, так и при макроцитозе отмечается тенденция к увеличению RDW-CV. SD - стандартное среднеквадратическое отклонение объема эритроцита от среднего значения . Норма: RDW-CV : 11.5-14.5 %

RDW -SD RDW-SD независим от MCV и представляет собой прямое измерение ширины эритроцитарной гистограммы на уровне 20% пика кривой. При этом высота пика RBC-гистограммы принимается за 100%. Норма RDW-SD - 42 /- 5 фл. Клинически значимое значение RDW-SD 60 фл. RDW-SD является более чувствительным показателем при наличии минорной популяции макроцитов или микроцитов, т.к. он измеряет нижнюю часть кривой распределения эритроцитов по объему. В то же время RDW-SD будет изменяться при высоком ретикулоцитозе в силу их большего объема, что расширяет основание кривой распределения эритроцитов. Анизоцитоз улавливается прибором значительно быстрее, чем при визуальном просмотре мазка крови.

Гистограммы эритроцитов: на что обращать внимание Типичная гистограмма распределения эритроцитов по объемам. Обратите внимание: небольшой пик на правом крыле распределения эритроцитов в области 110...150 фл не имеет диагностического значения, а является приборным артефактом. Наличие дополнительного максимума свидетельствует о гетерогенности популяции клеток (в данном случае наблюдается микроцитарная фракция). Гетерогенность популяции эритроцитов также сопровождается увеличением параметра RDWs. Выраженная ассиметрия контура также указывает на гетерогенность популяции эритроцитов (анизоцитоз). Данная гистограмма свидетельствует о наличии как микроцитов, так и макроцитов.

Гистограммы эритроцитов: на что обращать внимание Гистограмма больного ЖДА, принимающего препараты железа. Характерно присутствие микроцитов и увеличение количества нормоцитов. MCV – N , RDW - Гистограмма больного ЖДА. Выражен микроцитоз эритроцитов. MCV – MCH - MCHC - RDW - На гистограмме распределения тромбоцитов больного ЖДА виден перекрест с микроцитарной фракцией эритроцитов.

Пример 1 (скатерограмма)

Пример 2

Пример 3

Пример 4

Пример 5

Общая характеристика ретикулоцитов Ретикулоциты ( Reticulocytes, RET) Предшественники эритроцитов Наличие зернисто-нитчатой субстанции (остатки рибосом, митохондрий, РНК)

Стадии созревания ретикулоцитов По Хайлмейеру стадии 0- IV (основывается на количестве ретикулярного материала в цитоплазме) Russel B. M., Cooke B. M., Trends Parasitol, 2017 Стадии созревания RET % от RET в крови Стадия 0 - Стадия I 0.1 Стадия II 7.0 Стадия III 32.0 Стадия IV 61.0 В норме содержание RET в крови 0.2 – 1.2% от RBC

Оценка количества ретикулоцитов Подсчет ретикулоцитов в мазке (суправитальная окраска) Бриллиантовый крезиловый синий Азур I или Азур II Новый метиленовый синий ( NMB) Окраска на стекле или в пробирке Микроскоп – увеличение х1000 Иммерсионный объектив, масло Подсчет 1000 эритроцитов

Оценка количества ретикулоцитов Люминесцентная микроскопия Способность субстанции флюоресцировать после обработки акридиновым оранжевым . Подсчет аналогичен. А – ретикулоцит, В – ретикулоцит с микроядром DOI: 10.1590/S0100-879X2009001100015

Оценка количества ретикулоцитов Основные ретикулоцитарные параметры: RET% (percent of reticulocytes) – относительное (%) содержание ретикулоцитов (0.2-1.2%) где: RET% — содержание ретикулоцитов в %, А — количество ретикулоцитов, выраженное в , B — количество подсчитанных эритроцитов (1000) RET# (absolute count of reticulocytes) – абсолютное (х Г/л) содержание ретикулоцитов ( 10-70 х Г / л) где: RET# — абсолютное количество ретикулоцитов, RET% — содержание ретикулоцитов в %, RBC — количество эритроцитов у обследуемого пациента, выраженное в 10 12 /л.

Оценка количества ретикулоцитов Автоматический подсчет Высокая точность Большое количество параметров: RET% – относительное содержание RET RET# – абсолютное содержание RET MCVr – средний объем RET CHCMr – средняя концентрация Hb в RET CHr – среднее количество Hb в RET LFR % – ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые; MFR % – ретикулоциты со средним содержанием РНК; HFR % – ретикулоциты с высоким содержанием РНК, IRF % – незрелая фракция ретикулоцитов.

В гематологических анализаторах серии фирмы Sysmex применяется метод проточной цитофлюориметрии с использованием флюоресцентного красителя полиметина. Этот флюоресцентный краситель связывается с ДНК и РНК неизмененных клеток, что позволяет использовать его как для дифференцировки лейкоцитов по 5-ти параметрам, так и для подсчета ретикулоцитов.

Анализ клеток происходит в проточной кювете при пересечении луча лазера длиной 633 нм. После контакта лазерного луча с окрашенной клеткой происходит рассеивание последнего под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Данные сигналы улавливаются фотоумножителями и регистрируются в виде трех параметров. Светорассеивание под малым углом ( FSC ) - отклонение лазерного луча под малым (до 10 град.) углом, которое зависит от размера (объема, только при условии сферической формы частицы) и формы клетки. Боковое светорассеивание (SSC) - рассеивание под углом до 90 град. зависит от рефрактерного индекса (или плотности) клетки и характеризует сложность внутриклеточных структур. Детекция специфического флюоресцентного сигнала (SFL), которая регистрируется также как боковое светорассеивание под углом 90 град. и позволяет судить о содержании РНК/ДНК в клетках

Классические параметры ретикулоцитов RET% - относительное количество ретикулоцитов (0,2 – 1,2 %) RET# - абсолютное количество ретикулоцитов (х Г/л) Возможные ошибки измерения показателей ретикулоцитов Ложное завышение включения в эритроцитах (т. Жолли, малярийные паразиты) высокий лейкоцитоз аномальные формы гемоглобина гипертромбоцитоз гигантские тромбоциты

Объемные параметры ретикулоцитов MCVr (Mean Cell Volume Reticulocytes) - средний объем ретикулоцитов, (фл) MSRV (Mean Sphered Reticulocyte Volume) - средний объем сферических клеток, включающих эритроциты и ретикулоциты, фл Параметры, характеризующие степень зрелости ретикулоцитов LFR% - популяция малых зрелых RET (87 - 99%) MFR% - популяция средних RET (2 - 12%) HFR% - популяция больших незрелых RET (1 - 2%) IRF (Immature Reticulocyte Fraction) – сочетание показателей MFR HFR - определяется как фракция незрелых ретикулоцитов - (2-14%)

Фракция незрелых ретикулоцитов IRF является более чувствительным ранним индикатором эритропоэза, чем количество ретикулоцитов. индекс IRF в комбинации с подсчетом ретикулоцитов может быть использован для улучшения классификации форм анемии, мониторирования характеристики восстановления клеток костного мозга и терапии анемии Ретикулоцитоз с резким увеличением фракции незрелых ретикулоцитов на фоне активного эритропоэза отражает повышенную регенераторную способность костного мозга. Сохраняющийся ретикулоцитоз может свидетельствовать о продолжающемся кровотечении. Ретикулоцитопения - индикатор угнетения эритропоэза. Нормализация абсолютного количества ретикулоцитов (RET#) - показатель восстановления пролиферативной активности эритрокариоцитов.

Содержание Hb в ретикулоцитах RET-Y (расчетный показатель размера клеток по среднему значению FSC ), или Ret-He (норма 28,2-36,4 пг), или CHr ( Bayer Technicon H2 ) ( норма 28-32 пг). При усилении эритропоэза из костного мозга поступают в циркуляцию незрелые ретикулоциты, период созревания которых в крови удлиняется и составляет от 1,5 до 2,5 дней (см рис.). Появление незрелых ретикулоцитов в крови соответствует полихромазии эритроцитов в окрашенном мазке крови. 3,5 1,0 3,0 1,5 2,5 2,0 1,5 2,5 Гематокрит Костный мозг Ретикулоциты, дни Кровь Ретикулоциты, дни 45 35 25 15 Изменение длительности созревания ретикулоцитов при анемии

Ретикулоцитарные индексы RPI и CRC В случае изменения только гематокрита рассчитывается индекс CRC ( corrected reticulocyte count ) – скорректированный подсчет ретикулоцитов по формуле: Hematocrit (%) CRC RET% x ------------------------ 0,45 где RET% - количество ретикулоцитов (%), измеренное при данном гематокрите; 0,45 – идеальный гематокрит. Если у больного одновременно с низким гематокритом в периферической крови присутствуют незрелые ретикулоциты ( MFR И HFR ), то рассчитывают индекс продукции ретикулоцитов RPI ( reticulocyte prodaction index ): RET% x Ht RPI -------------------------------------------------- 0,45 x дни циркуляции RET в крови Снижение данного индекса менее 2 указывает на низкую пролиферативную активность эритрокариоцитов.

Исследование ретикулоцитов используется для: оценка активности эритропоэза при состояниях, сопровождающихся гемолизом или кровопотерей; детекция нарушения регенераторной способности костного мозга при дефиците железа, витаминов B12, В6, фолатов, меди и мониторинга соответствующей терапии; оценка состояния эритропоэза на фоне лечения эритропоэтином; оценка способности костного мозга к регенерации после цитотоксической терапии и трансплантации костного мозга; оценка восстановления синтеза эритропоэтина после трансплантации почки; допинговый контроль у спортсменов (прием эритропоэтина)