Презентация - Мутации

Мутации Основа генетики вот уже более полувека – мутационный анализ. Генетики либо вносят мутации в определенные гены и детектируют изменения фенотипа, либо наоборот, детектируют необычный фенотип и пытаются найти, какие именно мутации его вызвали. Говорить о мутациях нам придется много, поэтому необходимо сначала разобраться с соответствующей номенклатурой и дать определения некоторым понятиям. Номенклатура бактериальных генов Названия бактериальных генов записываются тремя латинскими прописными буквами. Обычно три эти буквы имеют какое-то отношение к функции гена. Например, ssb – ген, кодирующий S ingle S trand B inding protein, а lig – ген, кодирующий ДНК-лигазу. В случае если несколько генов кодируют белки с родственными функциями или белки, участвующие в одном метаболическом процессе, к их названиям могут добавляться заглавные буквы. Например, гены his A и his B кодируют ферменты, принимающие участие в многоступенчатом процессе биосинтеза гистидина.

Номенклатура фенотипов His означает, что данный бактериальный штамм может расти на среде без гистидина. Имеется в виду, что с генами семейства his у него все в порядке. His - означает, что данный бактериальный штамм не может расти на среде без гистидина. У такого штамма имеется мутация в каком-то из генов семейства his , в результате чего гистидин не может синтезироваться бактериальной клеткой и должен поступать извне, чтобы бактерия могла жить. Rif s означает, что данный бактериальный штамм чувствителен к антибиотику рифампицину (s от sensitive). Rif r означает, что данный бактериальный штамм устойчив к антибиотику рифампицину (r от resistant). Надо полагать, что у такого штамма мутация в гене rpo B , кодирующем бета-субъединицу РНК-полимеразы. Мутация делает невозможным связывание рифампицина, в результате чего бактерией приобретается устойчивость к антибиотику.

Ауксотрофные мутанты, или ауксотрофы – мутантные бактерии, не способные расти и вообще жить, если извне в них не поступает какой-либо компонент, в норме синтезирующийся самой бактерией. Бактерии с фенотипом His - - ауксотрофы. Катаболические мутанты - мутантные бактерии, не способные использовать для роста какое-либо вещество, которое используется бактериями в норме при его поступлении извне. Бактерии с фенотипом Mal - не способны расти на средах, в которых единственным источником углерода является сахар мальтоза, и поэтому относятся к катаболическим мутантам. Летальные мутации – мутации, приводящие к безусловной гибели бактериальной клетки. Поскольку такие мутации невозможно изучать (кроме самого факта их летальности), о них мы говорить практически не будем. Условно летальные мутации – мутации, приводящие к гибели бактериальной клетки только в каких-либо определенных условиях. Мутация, приводящая к фенотипу His - - условно летальная. Добавьте в среду гистидина, и бактерии с таким фенотипом будут отлично себя чувствовать. Температуро-чувствительные мутации приводят к тому, что при неоптимальной для бактерии (непермиссивной) температуре она не может расти, а при оптимальной (пермиссивной – может).

Изоляция условно-летальных ауксотрофных мутантов Аналогичным образом можно изолировать и катаболические, и температуро-чувствительные мутанты.

Мутации устойчивости приводят к тому, что мутанты способны расти в присутствии вещества, которое для нормальной бактерии является токсическим и приводит к ее гибели.

Важнейшее свойство бактериальных мутаций – их клональность . Если в бактериальной клетке случилась мутация, то все ее потомки будут также содержать данную мутацию (если выживут). Это позволяет легко отбирать мутантные бактерии в виде клонов на чашках Петри с агаризованными средами.

Типы мутаций Замена, делеция или вставка пары оснований (точечная мутация) Делеция Дупликация тандемных повторов Инверсия Вставка

Замена пары оснований Может случаться из-за ошибок репликации, радиационного повреждения, химических воздействий. Спаривание гуанина с альтернативной енольной формой тимина, являющееся распространенной причиной ошибочного встраивания Т напротив G при репликации.

Дезаминирование цитозина Происходит спонтанно с достаточно высокой частотой, особенно при повышенных температурах, с образованием урацила.

Удаление урацила из ДНК, где он совершенно не нужен

Последствия замены пары оснований Такие мутации фенотипически проявляются нечасто, поскольку с высокой вероятностью происходят в некодирующих участках генома. Если они случаются в генах РНК, они также могут никак не проявиться, а могут сделать соответствующую РНК нефункциональной, нарушив участок связывания с чем-либо или делая невозможным принятие должной вторичной структуры. Замены пары оснований в белковых генах подразделяются на три типа: Не меняющие аминокислотную последовательность белка и, соответственно, не имеющие фенотипических проявлений Миссенс-мутации (меняющие одну аминокислоту на другую) Нонсенс-мутации (меняющие кодон, кодирующий аминокислоту, на стоп-кодон). UAG – amber UAA – ochre UGA – opal

Делеция или вставка пары оснований Основная причина – наличие гомополимерных участков в составе ДНК. ДНК-полимераза плохо умеет считать повторяющиеся нуклеотиды и может вставить один лишний или пропустить один нужный.

Последствия делеции или вставки пары оснований Некодирующие участки генома или гены РНК – аналогично заменам пары оснований. Если делеция или вставка пары оснований происходит в белок-кодирующем гене, следствием этого является сдвиг рамки считывания . Соответственно, аминокислотная последовательность белка начиная с какого-то момента становится совершенно неправильной. В подавляющем большинстве случаев такие белки нефункциональны.

Делеции Спонтанно происходят достаточно редко. Основная причина – эктопическая рекомбинация, то есть рекомбинация, происходящая не там, где нужно. Условием эктопической рекомбинации является наличие ПРЯМЫХ повторов в ДНК. Обозначение делеции: Δ(lac-pro AB)195 – делеция №195, затрагивающая гены lac и pro AB.

Дупликации тандемных повторов Происходят одновременно с делециями и по тому же механизму. Однако же именно дупликация тандемных повторов, в отличие от делеции, может не приводить к появлению фенотипа!

Инверсии Происходят аналогично делециям, но при наличии ИНВЕРТИРОВАННЫХ повторов. Обозначение инверсий: IN( pur B-trp A)3 – инверсия №3, затрагивающая гены pur B и trp A.

Вставки Чаще всего происходят вследствие активности мобильных элементов генома. Об этом мы поговорим позже. Обозначение вставок: gal K35:: Tn 5 – транспозон Tn5 вставился в ген gal K в положение №35. Вставки – мощнейший инструмент генной инженерии. Допустим, вам требуется инактивировать ген his3 . Чтобы иметь возможность просто и быстро детектировать инактивацию, вы не просто вырезаете его из генома, а вставляете прямо в его последовательность ген устойчивости к канамицину, kan . Полученный вами штамм будет расти на среде с канамицином, и это будет однозначным указанием на то, что ген his3 инактивирован . Такая вставка обозначается как his3 Ω:: kan (Ω как знак генно-инженерной манипуляции; сегодня этой омегой пользуются только тру олдскульные микробиологи).

Вследствие высокой скорости мутагенеза у бактерий, эффект мутаций в их геноме часто сводится на нет при помощи последующих мутаций. Если компенсирующая мутантный фенотип мутация является строго обратной исходной мутации, то есть восстанавливает исходную последовательность ДНК, такая мутация называется реверсивной мутацией , или реверсией . Если компенсирующая мутантный фенотип мутация происходит в любом другом месте бактериального генома, кроме того, где имеет место исходная мутация, такая мутация называется супрессионной, или супрессорной, мутацией . Организмы с любым типом компенсаторной мутации называются ревертантами . Если в случае реверсии с механизмами все ясно, то с супрессией нам нужно разобраться поподробней. Супрессия Интрагенная (в том же гене) Обратный сдвиг ORF, Замена другой аминокислоты, восстанавливающая активность белка Интергенная (в другом гене) Появление белка, который: -восстанавливает активность мутантного белка, -начинает выполнять функцию мутантного белка, -сводит на нет дисфункцию, вызванную мутантным белком.

Классический пример интергенной супрессии: мутация в одном гене галактозного оперона супрессирует мутацию в другом гене этого же оперона Мутация в гене gal E приводит к накоплению токсичных промежуточных продуктов и гибели клеток на среде с галактозой. Супрессорная мутация в гене gal K приводит к тому, что токсичные продукты просто не образуются. Таким образом, клетки не гибнут в присутствии галактозы, хотя и не могут утилизировать ее (фенотип Gal-).

Нонсенс-супрессия Супрессия нонсенс-мутации посредством мутации в гене т РНК, благодаря которой ее антикодон становится комплементарен стоп-кодону, образовавшемуся в результате нонсенс-мутации. Вот нонсенс-мутация:

А вот нонсенс-супрессия: Последовательность белка будет другой, одна аминокислота заменится Супрессорная т РНК будет работать и на правильных стоп-кодонах, но это не очень страшно: с ними все равно будет чаще связываться фактор терминации RRF.

Анализ бактериальных мутаций Бактерии – удобнейший генетический объект! Поэтому мутационный анализ бактерий до сих пор остается крайне актуальным и используется огромным количеством научных коллективов. Бактерии – гаплоидные организмы, а это означает, что любая мутация моментально закрепляется в последующих поколениях (в лабораторных условиях, и если она не летальная, конечно). У бактерий отсутствует половое размножение, поэтому в норме две дочерние бактериальные клетки генетически идентичны родительской бактерии. У бактерий крайне высока скорость образования мутаций, особенно под селективным давлением, поэтому получать бактериальных ревертантов быстро и просто. Это позволяет с удивительной легкостью изолировать и анализировать бактериальных мутантов.

Селекция мутантов

Скрининг мутантов без селекции Метод «Replica-Plating» Существует громадное множество методов генетического/мутационного анализа бактерий, но рассказывать о них можно только в рамках отдельного курса